radiobutton1.Checked = false;

------解决方案--------------------
radiobutton1.Checked = !radiobutton1.Checked;

------解决方案--------------------
radiobutton1.Checked = !radiobutton1.Checked;

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点击的时候，默认就对它进行了一个check的设置。正常情况下是不能uncheck的。你只能对它重设计一下，在系统check它之后再uncheck一次。而且要保证你的代码在系统check它之后执行。

如果没有特别大的必要，就不要这样用了吧。鼠标都已经点击选中了，为什么还要uncheck呢？用户check另外一个选项的时候不就自动uncheck了吗？或者把它换成checkbox？

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探讨

radiobutton1.Checked = !radiobutton1.Checked;


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楼主的这个要求和单选按钮的AutoCheck相违背。如果一定要这样，只能将所有单选的AutoCheck设为false，自己实现选中和不选中的情况。
C# code

private void Form1_Load(object sender, EventArgs e)
        {
            radioButton1.CheckedChanged+=new EventHandler(radioButton1_CheckedChanged);
            radioButton2.CheckedChanged += new EventHandler(radioButton1_CheckedChanged);
            radioButton3.CheckedChanged+=new EventHandler(radioButton1_CheckedChanged);

            radioButton1.Click+=new EventHandler(radioButton1_Click);
            radioButton2.Click+=new EventHandler(radioButton1_Click);
            radioButton3.Click+=new EventHandler(radioButton1_Click);

            radioButton1.Checked = true; //初始选项，也可不设置任何初始选项。
}

    RadioButton lastChk;//最后一次选中状态的单选按钮
        private void radioButton1_Click(object sender, EventArgs e)
        {
            RadioButton rad = sender as RadioButton;
            if (lastChk != null && lastChk != rad)
            {
                lastChk.Checked = false;
            }
            rad.Checked = !rad.Checked;
            
        }

        private void radioButton1_CheckedChanged(object sender, EventArgs e)
        {
            RadioButton rad = sender as RadioButton;
            if (rad.Checked)
            {
                lastChk = rad;
            }
        }

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应该是不可能，要么你用一个隐藏的radiobutton，将这个设置为选中

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 TO :radioButton选中之后 在点击的时候 该radiobutton就为不选中状态？？？
  那你还不如使用 checkBox



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把按钮AutoCheck属性设成false
在Click事件中加radioButton4.Checked = !radioButton4.Checked;
别在CheckedChanged中事件中加